韓春雨

河北科技大學(xué)副教授韓春雨震驚全球?qū)W術(shù)界的新基因編輯技術(shù)NgAgo-gDNA，正遭遇越來越多的質(zhì)疑。從5月2日他的論文發(fā)布在《自然-生物技術(shù)》網(wǎng)絡(luò)版之后,，到現(xiàn)在為止,，全球仍沒有一家實驗室對外宣布,，能夠完全成功重復(fù)韓春雨的實驗?，F(xiàn)在已有多國科學(xué)家要求《自然-生物技術(shù)》介入調(diào)查,，并公開韓春雨實驗中的所有原始數(shù)據(jù)和實驗條件,。

北京時間7月29日,，一度支持韓春雨的澳大利亞國立大學(xué)的基因?qū)W家Gaetan Burgio,，反戈一擊。他在Twitter上發(fā)布長文《我的NgAgo經(jīng)歷》,，否認(rèn)了自己7月15日之前部分重復(fù)實驗時得出的結(jié)論,，表示并無嚴(yán)格意義上的證據(jù)顯示韓春雨的NgAgo-gDNA技術(shù)有基因編輯的跡象，并且要求韓春雨公開所有原始數(shù)據(jù)和實驗條件,。

韓春雨的NgAgo-gDNA技術(shù),，挑戰(zhàn)的是最為流行的基因編輯技術(shù)CRISPR-CAS9，論文剛一發(fā)表,，就引發(fā)了轟動,。基因編輯技術(shù)是指能夠讓人類對目標(biāo)基因進(jìn)行“編輯”,，實現(xiàn)對特定DNA片段的敲除,、加入等。目前CRISPR-CAS9是最為普遍的基因編輯技術(shù),，被稱為“基因魔剪”,。 5月2日，韓春雨課題組的論文《DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute》在《Nature Biotechnology》在線發(fā)表,。繞開時興的CRISPR-CAS9技術(shù),，課題組利用格氏嗜鹽堿桿菌（Natronobacterium gregoryi）的Argonaute核酸內(nèi)切酶，以DNA為介導(dǎo)進(jìn)行基因組編輯,，簡稱NgAgo-gDNA,。

質(zhì)疑韓春雨的Gaetan Burgio在7月29日發(fā)布的長文中介紹了重復(fù)實驗的具體過程操作和結(jié)論，附帶了7張實驗結(jié)果圖,。

受精卵原核注射NgAgo之后，基于囊胚的PCR結(jié)果,。

對NgAgo注射過的受精卵PCR產(chǎn)物的T7核酸內(nèi)切酶檢測,。

當(dāng)用高濃度5'磷酸化的ssDNA(25納克/微升)和NgAgo原核注射小鼠受精卵之后基于囊胚的PCR和電泳凝膠。

對小鼠囊胚進(jìn)行NgAgo,、5’磷酸化ssDNA原核共注射之后獲得囊胚,，進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增和測序之后的一個典型測序結(jié)果,。

微注射NgAgo的小鼠受精卵凝膠電泳,。

代表性的所有電泳膠的序列的Clustal比對。Ank-1作為參考序列,。

一個代表性測序色譜圖(使用反向引物測序),。

他表示：在多番嘗試,、試驗3個不同的細(xì)胞后，沒有發(fā)現(xiàn)嚴(yán)格意義上證明NgAgo發(fā)生基因編輯的證據(jù),；在他看來,，NgAgo酶需要加熱到50攝氏度才能有效，對37攝氏度下NgAgo內(nèi)切酶的活性表示質(zhì)疑,。

在長文中,，Gaetan Burgio表示，“《自然生物技術(shù)》期刊應(yīng)該要求韓春雨公開所有的原始數(shù)據(jù)和實驗條件”,，并認(rèn)為：“NgAgo的未來并不明朗,。”

Gaetan Burgio選擇了小鼠受精卵進(jìn)行重復(fù)實驗。因為他長期研究小鼠細(xì)胞,，較為熟悉,，并在兩年半前，用小鼠細(xì)胞,，完成了他的首次CRISPR-Cas9基因編輯,。由于韓春雨的論文中使用的是人體細(xì)胞，嚴(yán)格意義上來說,，Gaetan Burgio和韓春雨所做的不是同一個實驗,。但由于小鼠和人體結(jié)構(gòu)相似，一般認(rèn)為人體細(xì)胞能完成的實驗也能在小鼠細(xì)胞上進(jìn)行,。

在Gaetan Burgio發(fā)文后不久,，來自西班牙高等科學(xué)委員會（CSIC）下設(shè)的國立生物技術(shù)中心（Centro Nacional de Biotecnologia）的科學(xué)家Lluis Montoliu轉(zhuǎn)發(fā)了該文，并在Twitter上寫道：“CRISPR萬歲?。,。RISPR-Cas9系統(tǒng)會用上數(shù)百億萬年而不衰,。難以擊垮,。”

據(jù)公開資料顯示，2015年,，Lluis Montoliu從非營利組織“國際轉(zhuǎn)基因技術(shù)協(xié)會”（The International Society for Transgenic Technologies）卸任主席之位,。他的Twitter簡介顯示，Lluis Montoliu的研究方向是哺乳動物的基因組,，以及基于轉(zhuǎn)基因動物研究人類的罕見疾病,。

Lluis Montoliu在Twitter上透露，在NgAgo之前,，他們曾用大約2年時間,，試圖測試Ago家族中來自Thermus thermophiles嗜熱棲熱菌的酶TtAgo，但同樣失敗。

隨后,，7月30日,，Lluis Montoliu更新博文稱，他已經(jīng)停止了所有關(guān)于NgAgo的項目,，同時“建議所有想做這件事人不要再浪費資源”,。

7月30日傍晚，方舟子在Twitter上貼出四張郵件截圖,，并附文稱“國際轉(zhuǎn)基因技術(shù)協(xié)會原主席Montoliu今天向協(xié)會會員發(fā)信,，建議停止驗證河北科大韓春雨實驗，不要再浪費時間,、金錢和人員,。針對該技術(shù)調(diào)查表明，140個回復(fù)中,，只有一個（中國神經(jīng)所仇子龍,？）回答有效，73 個無效,，63 個在驗證,。”

圖片顯示，發(fā)件方為代表Lluis Montoliu的“國際轉(zhuǎn)基因技術(shù)協(xié)會”,，郵件名為“對Ago的巨大失望：CRISPR萬歲,！”，發(fā)送時間為當(dāng)?shù)貢r間7月29日上午9點49分,。郵件用加粗字體寫道：“（目前最重要的信息是）NgAgo在哺乳動物細(xì)胞的基因編輯中不起作用”,、“我建議所有人放棄涉及NgAgo的項目”。

方舟子所貼的郵件截圖,。

但Lluis Montoliu及其所處的“國際轉(zhuǎn)基因技術(shù)協(xié)會”的言論,，引發(fā)了部分國內(nèi)科學(xué)家的不滿，其中包括中國科學(xué)院上海神經(jīng)科學(xué)研究所研究員仇子龍,。7月30日晚上,，他在實名認(rèn)證的微博上質(zhì)疑“國際轉(zhuǎn)基因技術(shù)協(xié)會”和Lluis Montoliu在領(lǐng)域內(nèi)的專業(yè)性。

仇子龍發(fā)文質(zhì)疑“國際轉(zhuǎn)基因技術(shù)協(xié)會”和Lluis Montoliu在領(lǐng)域內(nèi)的專業(yè)性,。

此前,，仇子龍被傳出重復(fù)實驗成功。7月20日,，科學(xué)網(wǎng)有博文稱仇子龍成功重復(fù)韓春雨的實驗。但仇子龍本人在7月21日作出回應(yīng),，表示實驗室仍在重復(fù),，優(yōu)化各種條件，目前的實驗結(jié)果距離韓春雨論文中的結(jié)果“相差甚遠(yuǎn)”,，并呼吁韓春雨提供“可重復(fù)NBT發(fā)表文章的NgAgo,，或者優(yōu)化的Ngago2.0,，smart版本等等”。

對NgAgo的質(zhì)疑聲自6月下旬開始就陸陸續(xù)續(xù),，韓春雨本人在百度貼吧上做出過一些回應(yīng),。

6月28日，他在對網(wǎng)友的回復(fù)中表示,，新系統(tǒng)剛出來都會“不好使”,，他也認(rèn)同目前NgAgo系統(tǒng)不夠穩(wěn)定，等2.0版本出來會找專門機(jī)構(gòu)免費發(fā)放,。

面對質(zhì)疑,，他說，“我敢把質(zhì)粒提交到addgen上,，在協(xié)和講座發(fā)放質(zhì)粒,，對自己實驗的重復(fù)性還是很有膽氣的。”韓春雨所說的“addgen”其實是Addgene,，一家全球科學(xué)家質(zhì)粒共享的非盈利組織,。澎湃新聞（www.thepaper.cn）在Addgene官網(wǎng)上的確看到了韓春雨上傳的質(zhì)粒信息。這些質(zhì)?？晒┤蚩茖W(xué)家直接用于重復(fù)韓春雨的實驗,。

7月2日，在貼有方舟子質(zhì)疑原文的帖子中,，韓春雨進(jìn)行了較為詳細(xì)的回應(yīng),，強調(diào)NgAgo系統(tǒng)對污染特別敏感，實驗時不要有寄生菌和支原體的污染,，并對實驗環(huán)節(jié)做出技術(shù)性的建議,。

但7月2日之后，韓春雨不再有新的回復(fù),。7月4日,，澎湃新聞（www.thepaper.cn）聯(lián)系上韓春雨，他以“學(xué)校告訴我不要做任何回應(yīng)”回絕,。

有基因?qū)W家對澎湃新聞（www.thepaper.cn）表示,，如果最終《自然-生物技術(shù)》雜志在介入調(diào)查后也認(rèn)為韓春雨的實驗是無效的，那么他在5月2日發(fā)表的論文將會被《自然-生物技術(shù)》刪除,。