韓春雨

河北科技大學(xué)副教授韓春雨震驚全球?qū)W術(shù)界的新基因編輯技術(shù)NgAgo-gDNA,，正遭遇越來(lái)越多的質(zhì)疑,。從5月2日他的論文發(fā)布在《自然-生物技術(shù)》網(wǎng)絡(luò)版之后,，到現(xiàn)在為止,，全球仍沒(méi)有一家實(shí)驗(yàn)室對(duì)外宣布,，能夠完全成功重復(fù)韓春雨的實(shí)驗(yàn)?，F(xiàn)在已有多國(guó)科學(xué)家要求《自然-生物技術(shù)》介入調(diào)查，并公開(kāi)韓春雨實(shí)驗(yàn)中的所有原始數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)條件,。

北京時(shí)間7月29日,，一度支持韓春雨的澳大利亞國(guó)立大學(xué)的基因?qū)W家Gaetan Burgio，反戈一擊,。他在Twitter上發(fā)布長(zhǎng)文《我的NgAgo經(jīng)歷》,，否認(rèn)了自己7月15日之前部分重復(fù)實(shí)驗(yàn)時(shí)得出的結(jié)論，表示并無(wú)嚴(yán)格意義上的證據(jù)顯示韓春雨的NgAgo-gDNA技術(shù)有基因編輯的跡象,，并且要求韓春雨公開(kāi)所有原始數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)條件,。

韓春雨的NgAgo-gDNA技術(shù)，挑戰(zhàn)的是最為流行的基因編輯技術(shù)CRISPR-CAS9,，論文剛一發(fā)表,，就引發(fā)了轟動(dòng)?；蚓庉嫾夹g(shù)是指能夠讓人類對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行“編輯”,，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定DNA片段的敲除、加入等,。目前CRISPR-CAS9是最為普遍的基因編輯技術(shù),，被稱為“基因魔剪”,。 5月2日,，韓春雨課題組的論文《DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute》在《Nature Biotechnology》在線發(fā)表。繞開(kāi)時(shí)興的CRISPR-CAS9技術(shù),，課題組利用格氏嗜鹽堿桿菌（Natronobacterium gregoryi）的Argonaute核酸內(nèi)切酶,，以DNA為介導(dǎo)進(jìn)行基因組編輯,，簡(jiǎn)稱NgAgo-gDNA,。

質(zhì)疑韓春雨的Gaetan Burgio在7月29日發(fā)布的長(zhǎng)文中介紹了重復(fù)實(shí)驗(yàn)的具體過(guò)程操作和結(jié)論，附帶了7張實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖,。

受精卵原核注射NgAgo之后,，基于囊胚的PCR結(jié)果,。

對(duì)NgAgo注射過(guò)的受精卵PCR產(chǎn)物的T7核酸內(nèi)切酶檢測(cè),。

當(dāng)用高濃度5'磷酸化的ssDNA(25納克/微升)和NgAgo原核注射小鼠受精卵之后基于囊胚的PCR和電泳凝膠,。

對(duì)小鼠囊胚進(jìn)行NgAgo、5’磷酸化ssDNA原核共注射之后獲得囊胚,，進(jìn)行DNA提取,、PCR擴(kuò)增和測(cè)序之后的一個(gè)典型測(cè)序結(jié)果。

微注射NgAgo的小鼠受精卵凝膠電泳,。

代表性的所有電泳膠的序列的Clustal比對(duì),。Ank-1作為參考序列。

一個(gè)代表性測(cè)序色譜圖(使用反向引物測(cè)序),。

他表示：在多番嘗試,、試驗(yàn)3個(gè)不同的細(xì)胞后,，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)嚴(yán)格意義上證明NgAgo發(fā)生基因編輯的證據(jù),；在他看來(lái),，NgAgo酶需要加熱到50攝氏度才能有效,，對(duì)37攝氏度下NgAgo內(nèi)切酶的活性表示質(zhì)疑。

在長(zhǎng)文中,，Gaetan Burgio表示,，“《自然生物技術(shù)》期刊應(yīng)該要求韓春雨公開(kāi)所有的原始數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)條件”，并認(rèn)為：“NgAgo的未來(lái)并不明朗,。”

Gaetan Burgio選擇了小鼠受精卵進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。因?yàn)樗L(zhǎng)期研究小鼠細(xì)胞,，較為熟悉,，并在兩年半前，用小鼠細(xì)胞,，完成了他的首次CRISPR-Cas9基因編輯,。由于韓春雨的論文中使用的是人體細(xì)胞，嚴(yán)格意義上來(lái)說(shuō),，Gaetan Burgio和韓春雨所做的不是同一個(gè)實(shí)驗(yàn),。但由于小鼠和人體結(jié)構(gòu)相似，一般認(rèn)為人體細(xì)胞能完成的實(shí)驗(yàn)也能在小鼠細(xì)胞上進(jìn)行,。

在Gaetan Burgio發(fā)文后不久,，來(lái)自西班牙高等科學(xué)委員會(huì)（CSIC）下設(shè)的國(guó)立生物技術(shù)中心（Centro Nacional de Biotecnologia）的科學(xué)家Lluis Montoliu轉(zhuǎn)發(fā)了該文,，并在Twitter上寫道：“CRISPR萬(wàn)歲?。?！CRISPR-Cas9系統(tǒng)會(huì)用上數(shù)百億萬(wàn)年而不衰,。難以擊垮,。”

據(jù)公開(kāi)資料顯示，2015年,，Lluis Montoliu從非營(yíng)利組織“國(guó)際轉(zhuǎn)基因技術(shù)協(xié)會(huì)”（The International Society for Transgenic Technologies）卸任主席之位,。他的Twitter簡(jiǎn)介顯示，Lluis Montoliu的研究方向是哺乳動(dòng)物的基因組,，以及基于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究人類的罕見(jiàn)疾病,。

Lluis Montoliu在Twitter上透露，在NgAgo之前,，他們?cè)么蠹s2年時(shí)間,，試圖測(cè)試Ago家族中來(lái)自Thermus thermophiles嗜熱棲熱菌的酶TtAgo，但同樣失敗,。

隨后,，7月30日，Lluis Montoliu更新博文稱,，他已經(jīng)停止了所有關(guān)于NgAgo的項(xiàng)目,，同時(shí)“建議所有想做這件事人不要再浪費(fèi)資源”。

7月30日傍晚,，方舟子在Twitter上貼出四張郵件截圖,，并附文稱“國(guó)際轉(zhuǎn)基因技術(shù)協(xié)會(huì)原主席Montoliu今天向協(xié)會(huì)會(huì)員發(fā)信，建議停止驗(yàn)證河北科大韓春雨實(shí)驗(yàn),，不要再浪費(fèi)時(shí)間,、金錢和人員。針對(duì)該技術(shù)調(diào)查表明,，140個(gè)回復(fù)中，只有一個(gè)（中國(guó)神經(jīng)所仇子龍,？）回答有效,，73 個(gè)無(wú)效，63 個(gè)在驗(yàn)證,。”

圖片顯示,，發(fā)件方為代表Lluis Montoliu的“國(guó)際轉(zhuǎn)基因技術(shù)協(xié)會(huì)”，郵件名為“對(duì)Ago的巨大失望：CRISPR萬(wàn)歲,！”,，發(fā)送時(shí)間為當(dāng)?shù)貢r(shí)間7月29日上午9點(diǎn)49分。郵件用加粗字體寫道：“（目前最重要的信息是）NgAgo在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因編輯中不起作用”,、“我建議所有人放棄涉及NgAgo的項(xiàng)目”,。

方舟子所貼的郵件截圖。

但Lluis Montoliu及其所處的“國(guó)際轉(zhuǎn)基因技術(shù)協(xié)會(huì)”的言論，引發(fā)了部分國(guó)內(nèi)科學(xué)家的不滿,，其中包括中國(guó)科學(xué)院上海神經(jīng)科學(xué)研究所研究員仇子龍,。7月30日晚上，他在實(shí)名認(rèn)證的微博上質(zhì)疑“國(guó)際轉(zhuǎn)基因技術(shù)協(xié)會(huì)”和Lluis Montoliu在領(lǐng)域內(nèi)的專業(yè)性,。

仇子龍發(fā)文質(zhì)疑“國(guó)際轉(zhuǎn)基因技術(shù)協(xié)會(huì)”和Lluis Montoliu在領(lǐng)域內(nèi)的專業(yè)性。

此前,，仇子龍被傳出重復(fù)實(shí)驗(yàn)成功,。7月20日，科學(xué)網(wǎng)有博文稱仇子龍成功重復(fù)韓春雨的實(shí)驗(yàn),。但仇子龍本人在7月21日作出回應(yīng),，表示實(shí)驗(yàn)室仍在重復(fù)，優(yōu)化各種條件,，目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果距離韓春雨論文中的結(jié)果“相差甚遠(yuǎn)”,，并呼吁韓春雨提供“可重復(fù)NBT發(fā)表文章的NgAgo，或者優(yōu)化的Ngago2.0,，smart版本等等”,。

對(duì)NgAgo的質(zhì)疑聲自6月下旬開(kāi)始就陸陸續(xù)續(xù)，韓春雨本人在百度貼吧上做出過(guò)一些回應(yīng),。

6月28日,，他在對(duì)網(wǎng)友的回復(fù)中表示，新系統(tǒng)剛出來(lái)都會(huì)“不好使”,，他也認(rèn)同目前NgAgo系統(tǒng)不夠穩(wěn)定,，等2.0版本出來(lái)會(huì)找專門機(jī)構(gòu)免費(fèi)發(fā)放。

面對(duì)質(zhì)疑,，他說(shuō),，“我敢把質(zhì)粒提交到addgen上，在協(xié)和講座發(fā)放質(zhì)粒,，對(duì)自己實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性還是很有膽氣的,。”韓春雨所說(shuō)的“addgen”其實(shí)是Addgene，一家全球科學(xué)家質(zhì)粒共享的非盈利組織,。澎湃新聞（www.thepaper.cn）在Addgene官網(wǎng)上的確看到了韓春雨上傳的質(zhì)粒信息,。這些質(zhì)粒可供全球科學(xué)家直接用于重復(fù)韓春雨的實(shí)驗(yàn),。

7月2日,，在貼有方舟子質(zhì)疑原文的帖子中，韓春雨進(jìn)行了較為詳細(xì)的回應(yīng),，強(qiáng)調(diào)NgAgo系統(tǒng)對(duì)污染特別敏感,，實(shí)驗(yàn)時(shí)不要有寄生菌和支原體的污染，并對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)做出技術(shù)性的建議。

但7月2日之后,，韓春雨不再有新的回復(fù),。7月4日，澎湃新聞（www.thepaper.cn）聯(lián)系上韓春雨,，他以“學(xué)校告訴我不要做任何回應(yīng)”回絕,。

有基因?qū)W家對(duì)澎湃新聞（www.thepaper.cn）表示，如果最終《自然-生物技術(shù)》雜志在介入調(diào)查后也認(rèn)為韓春雨的實(shí)驗(yàn)是無(wú)效的,，那么他在5月2日發(fā)表的論文將會(huì)被《自然-生物技術(shù)》刪除,。