中央紅軍主力長征后，他任瑞（金）會(huì)（昌）縣游擊司令部參謀長,，在長汀,、瑞金、會(huì)昌交界的武夷山區(qū)堅(jiān)持了極其艱苦的3年游擊戰(zhàn)爭,。1937年春任汀瑞游擊支隊(duì)參謀長,，繼續(xù)在閩贛邊堅(jiān)持游擊戰(zhàn)爭。

1937年抗戰(zhàn)爆發(fā)后,，周桂生奉命奔赴皖南抗日前線,。到達(dá)安徽太平以后，新四軍4個(gè)支隊(duì)勝利會(huì)師,。他從1938年起任新四軍第2支隊(duì)副團(tuán)長,、團(tuán)長，皖南第2縱隊(duì)司令員,。在抗日前線,，他身先士卒，經(jīng)歷了無數(shù)次戰(zhàn)斗,，多次率部痛擊日偽軍,。

1940年12月底，新四軍老三團(tuán),、新三團(tuán)奉命合編為新四軍第二支隊(duì),，周桂生任司令員。1941年1月,，國民黨頑固派制造皖南事變,，新四軍皖南部隊(duì)遭到包圍，新四軍決定,，除軍直機(jī)關(guān)部隊(duì)外,，編成3個(gè)縱隊(duì)，周桂生任第二縱隊(duì)司令員,，率第二縱隊(duì)為中央縱隊(duì),，掩護(hù)軍直屬隊(duì)及教導(dǎo)總隊(duì)突圍。

為了保護(hù)軍首長的安全,，周桂生親臨前沿陣地指揮作戰(zhàn),。13日黃昏,，率部轉(zhuǎn)移至獅形山西北高地時(shí)，遭遇敵人重兵圍攻,。激戰(zhàn)中,，周桂生身上多處中彈，仍端槍沖向敵人,，掩護(hù)戰(zhàn)友突圍,，最終壯烈犧牲，時(shí)年35歲,。