新冠肺炎疫情發(fā)生以來，關(guān)于核酸檢測(cè)假陰性率過高的話題,，一直是各方關(guān)注的焦點(diǎn),。有報(bào)道稱,，以熒光定量RT-PCR作為檢測(cè)手段的新冠病毒檢測(cè)的陽性率目前僅有30%—50%,，導(dǎo)致奇高的假陰性率,。

導(dǎo)致假陰性率發(fā)生的原因很多,。2月22日,，南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所發(fā)育生物學(xué)與遺傳學(xué)教授趙慶順接受科技日?qǐng)?bào)記者獨(dú)家采訪時(shí)指出,，依據(jù)有關(guān)機(jī)構(gòu)發(fā)布的指南,，核酸檢測(cè)前需將采集到的樣品進(jìn)行56℃滅活,，這極有可能使新冠病毒核酸被降解,，從而導(dǎo)致不能被正常檢出，最終提高了假陰性率,。該研究成果《病毒核酸提取前的高溫滅活過程顯著降低可檢出病毒核酸模板量》,，已在中國(guó)科學(xué)院科技論文平臺(tái)預(yù)發(fā)布。

56℃滅活可能導(dǎo)致病毒核酸被降解

2019新型冠狀病毒的遺傳物質(zhì)是單鏈RNA,。因此,，科研人員的目標(biāo)是在患者身上找到新冠病毒的RNA。這也是臨床診斷金標(biāo)準(zhǔn),。

目前,，臨床檢測(cè)主要采用熒光定量RT-PCR試劑盒檢測(cè)。該方法是將標(biāo)本中的特定RNA序列逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行擴(kuò)增,，經(jīng)過30次以上擴(kuò)增后，病毒基因片段達(dá)到一定數(shù)量即可進(jìn)行可視檢測(cè),。

“理論上,，哪怕模板只有1個(gè)病毒，就有可能被檢測(cè)出來,?！壁w慶順說，科研實(shí)踐中,，在模板（病毒）量大于100個(gè)的情況下，擴(kuò)增結(jié)果就會(huì)非常穩(wěn)定,。

但是,，趙慶順在網(wǎng)絡(luò)上看到一個(gè)教學(xué)視頻,，不禁心生疑慮。該視頻由北京協(xié)和醫(yī)院和北京市衛(wèi)健委聯(lián)合制作,。視頻3分08秒至3分40秒顯示：在制備核酸模板前，需將采集到的樣品在56℃條件下進(jìn)行30分鐘病毒滅活,。

記者在中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會(huì)發(fā)布的《2019新型冠狀病毒肺炎臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的生物安全防護(hù)指南（試行第一版）》中也看到：核酸擴(kuò)增前,，可以對(duì)標(biāo)本先行消毒。包括56℃孵育30分鐘,，加蛋白酶K。

中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會(huì)發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎病毒核酸檢測(cè)專家共識(shí)》中，明確指出需將樣品56℃孵育至少45分鐘或更高溫度進(jìn)行滅活,。

記者通過采訪確認(rèn),，絕大多數(shù)檢驗(yàn)醫(yī)師均按照上述規(guī)范,，進(jìn)行56℃條件下時(shí)間不等的病毒滅活，然后才制備核酸模板,。

這樣做帶來的問題是,，病毒RNA極易被核糖核酸酶降解,，因?yàn)檫@種酶在60℃時(shí)活性最高,。核糖核酸酶來自兩方面，一是樣本細(xì)胞內(nèi),，二是采集,、保存,、運(yùn)輸過程中的外來污染物,。

進(jìn)行滅活處理是出于生物安全的考慮

“進(jìn)行滅活處理是出于生物安全的考慮，保護(hù)從事檢測(cè)的工作人員不被病毒感染,?！壁w慶順說,。

正是出于這方面的考慮，國(guó)家衛(wèi)健委發(fā)布的相關(guān)文件中,，明確要求對(duì)標(biāo)本進(jìn)行滅活處理。

北京協(xié)和醫(yī)院制作的教學(xué)視頻以及中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會(huì)發(fā)布的《防護(hù)指南》和《專家共識(shí)》,，依據(jù)正是來自國(guó)家衛(wèi)健委相關(guān)文件,，包括《新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室生物安全指南（第二版）》《新型冠狀病毒肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南（第三版）》等,。

但是,，記者查詢了國(guó)家衛(wèi)健委相關(guān)文件,，其對(duì)于病毒滅活的具體方法并未做出明確規(guī)定，只是籠統(tǒng)地要求：感染性材料或活病毒在采用可靠的方法滅活后進(jìn)行的核酸檢測(cè),。

趙慶順進(jìn)一步查閱了美國(guó)疾控中心,、香港大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院以及華大基因發(fā)布的核酸檢測(cè)說明,，也未發(fā)現(xiàn)56℃滅活這一步驟。

病毒核酸降解對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響究竟有多大

記者在采訪中發(fā)現(xiàn),，不同人士對(duì)這個(gè)問題的回答涇渭分明：

來自疾控部門,、中國(guó)醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會(huì),、相關(guān)醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)師的看法是，不會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果有太大的影響,。而趙慶順等專家認(rèn)為,，核酸提取前對(duì)人體樣品進(jìn)行高溫殺毒處理,，可能是導(dǎo)致新冠病毒核酸檢出假陰性率過高的重要原因之一,。

趙慶順以豬流行性腹瀉病毒（一種冠狀病毒,，來自活疫苗）為模型開展了高溫滅活對(duì)病毒可檢出量影響的研究,，結(jié)果表明：保存在普通等滲溶液（Hank’s液）中的樣品經(jīng)56℃孵育30分鐘，導(dǎo)致樣品中可檢出的冠狀病毒模板減少一半,，如果以92℃孵育5分鐘,，則可檢出的冠狀病毒模板損失96%以上。

“理論上,，不排除新冠病毒的目標(biāo)RNA片段在56℃以上高溫滅活中不易被降解的可能?！壁w慶順坦言，“但我寧愿自己的判斷是錯(cuò)的,，也不希望因?yàn)槟硞€(gè)細(xì)節(jié)考慮不周而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陰性,?！?/p>

另外，不同品牌的樣品保存液,，也會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生較大影響,。趙慶順在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),，在56℃30分鐘條件下,，采用南京諾唯贊研發(fā)的R503保存液存放豬流行性腹瀉病毒樣品時(shí),，病毒核酸的可檢出量是對(duì)照組（Hank’s液）檢出量的3倍；而如果是92℃5分鐘滅活,，則檢出量是對(duì)照組的42倍,。

中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會(huì)主任委員王成彬教授在撰文回應(yīng)核酸檢測(cè)假陰性率較高現(xiàn)象時(shí)也指出，不同提取試劑對(duì)最后提取到的核酸數(shù)量和質(zhì)量可能存在差別,，從而直接影響檢測(cè)結(jié)果,。他建議，對(duì)于某些高度疑似病例,，或檢測(cè)結(jié)果難以確定的病例,，建議用2種以上試劑進(jìn)行檢測(cè),、驗(yàn)證。

“假陰性意味著漏檢,，不僅會(huì)導(dǎo)致臨床中對(duì)疑似患者不能快速確診，而且會(huì)使漏檢者成為潛在的病毒傳染源,。”趙慶順為此提出建議,，一是盡量使用無核糖核酸酶污染的樣本采集管，二是將標(biāo)本放置在可保護(hù)病毒核酸免受高溫滅活損壞的樣品保存液中,，從而確保樣品RNA從保存,、運(yùn)輸?shù)礁邷販缁畹鹊玫饺瘫Ｗo(hù),，盡最大可能保證用于臨床檢測(cè)的核酸質(zhì)量,，減少病毒核酸可檢出模板在核酸提取前的人為損壞,。