２０世紀(jì)８０年代初,，工作于歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的雅克·杜博歇提出了“急速冷卻”方案,，奠定了低溫冷凍電子顯微術(shù)樣本制備與觀察的基本技術(shù)手段,。冷凍可以對(duì)樣本起到保護(hù)作用,，但通常的冷凍過(guò)程中,，樣本里的水會(huì)結(jié)成冰晶,，可能使物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。更重要的是,，冰晶會(huì)“喧賓奪主”,，使電子發(fā)生強(qiáng)烈衍射，干擾觀測(cè),。杜博歇用液氮對(duì)生物大分子溶液薄膜進(jìn)行瞬間冷凍,，使水來(lái)不及結(jié)晶而是形成無(wú)定形的“玻璃態(tài)”，就不會(huì)產(chǎn)生衍射,。

電子顯微鏡觀測(cè)的樣本通常是只含一層分子的薄膜,，可以視為二維的。對(duì)大量散布的同一種分子拍攝二維圖像,，再把這些圖像整合起來(lái),，就可以得到該分子的三維圖像。２０世紀(jì)７０年代,，在紐約沃茲沃思研究中心工作的約阿希姆·弗蘭克開(kāi)始進(jìn)行這種“三維重構(gòu)”的理論研究,，開(kāi)發(fā)出了多種數(shù)學(xué)工具和圖像處理方法。

１９９０年,，英國(guó)劍橋分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的理查德·亨德森小組報(bào)告了他們對(duì)一種色素蛋白進(jìn)行的三維重構(gòu),，這項(xiàng)成果是低溫冷凍電子顯微術(shù)的重要里程碑，證明“冷凍樣本－二維成像－三維重構(gòu)”的確可以得到高分辨率的三維圖像,。它標(biāo)志著一種研究生物大分子結(jié)構(gòu)的新方法已經(jīng)成形,，其思路與Ｘ射線晶體學(xué)迥異，可以給生物體內(nèi)溶液中,、處于工作狀態(tài)的分子“抓拍”快照,。

不過(guò)此后相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間里，低溫冷凍電子顯微術(shù)的精度都不太高,，無(wú)法與Ｘ射線晶體學(xué)相比,。這里既有觀測(cè)手段的原因，也有計(jì)算機(jī)發(fā)展水平的限制,。

近幾年來(lái),，傳統(tǒng)的電子顯微術(shù)照相機(jī)被可以直接檢測(cè)電子的設(shè)備取代,，解決了圖像轉(zhuǎn)換導(dǎo)致細(xì)節(jié)丟失的問(wèn)題，這個(gè)重大進(jìn)展也是亨德森的貢獻(xiàn),。輔以新的高分辨率圖像處理算法,，以及突飛猛進(jìn)的計(jì)算機(jī)運(yùn)算能力，低溫冷凍電子顯微術(shù)的“高清時(shí)代”終于來(lái)臨,，例如２０１６年發(fā)布的谷氨酸脫氫酶結(jié)構(gòu),，分辨率達(dá)到了１．８埃（１埃等于１０的負(fù)１０次方米）。