中央紅軍主力長征后,，他任瑞（金）會（昌）縣游擊司令部參謀長,，在長汀、瑞金,、會昌交界的武夷山區(qū)堅持了極其艱苦的3年游擊戰(zhàn)爭。1937年春任汀瑞游擊支隊參謀長,，繼續(xù)在閩贛邊堅持游擊戰(zhàn)爭,。

1937年抗戰(zhàn)爆發(fā)后，周桂生奉命奔赴皖南抗日前線,。到達安徽太平以后,，新四軍4個支隊勝利會師。他從1938年起任新四軍第2支隊副團長,、團長,，皖南第2縱隊司令員。在抗日前線,，他身先士卒,，經(jīng)歷了無數(shù)次戰(zhàn)斗，多次率部痛擊日偽軍,。

1940年12月底,，新四軍老三團、新三團奉命合編為新四軍第二支隊,，周桂生任司令員。1941年1月,，國民黨頑固派制造皖南事變,，新四軍皖南部隊遭到包圍，新四軍決定,，除軍直機關(guān)部隊外,，編成3個縱隊，周桂生任第二縱隊司令員,，率第二縱隊為中央縱隊,，掩護軍直屬隊及教導總隊突圍,。

為了保護軍首長的安全，周桂生親臨前沿陣地指揮作戰(zhàn),。13日黃昏,，率部轉(zhuǎn)移至獅形山西北高地時，遭遇敵人重兵圍攻,。激戰(zhàn)中,，周桂生身上多處中彈，仍端槍沖向敵人,，掩護戰(zhàn)友突圍,，最終壯烈犧牲，時年35歲,。